Ако търсите надеждно ръководство за подготовка и анализ на кръвна натривка по Гимза за диагностика на паразити като Babesia, Plasmodium (malarial), Theileria, Anaplasma и други, тази статия ще ви покаже всяка важна стъпка. От пробовземането на капилярна кръв до микроскопското наблюдение на тънкия слой. Освен това ще разберете кога и защо се използва тъмнополева микроскопия (Dark Field Microscopy), какви са нейните предимства при търсене на спирохети и как да оптимизирате пробите си за максимална точност на резултатите.
Подготовка и вземане на кръв за кръвна натривка по Гимза
Когато се търси наличие на паразити, бактерии и други микроорганизми в кръвта, един от класическите и доказани методи на светлинна микроскопия е натривката по метода на Гимза. За да се извърши това изследване, първо трябва да се заяви услугата като „кръвна натривка по Гимза“ в лабораторията. Желателно е предварително да се уточни дали лабораторията работи с оцветяване по Гимза, тъй като не всички места го предлагат или го изпълняват с нужната прецизност.
Кръвта, използвана за това изследване, трябва да бъде капилярна периферна кръв, обикновено добита чрез убождане на върха на пръста или понякога, на меката част на ухото (често при кърмачета). Използването на капилярна кръв, а не венозна, има обективни предимства. Кръвта в периферната мрежа, особено в края на капилярите, е по-гъста, с по-висока концентрация на микроорганизми, когато те присъстват в тялото. Това се дължи както на по-бавния кръвоток и повишеното време на контакт между микроорганизмите и ендотела, така и на феномена на „маргинализация“, при който патогените могат да се събират в периферната кръв. Например при бабезиоза или малария паразитите са много по-видими в капилярна кръв, особено при правилно направена натривка.
Добра практика е преди вземането на кръвта да се извърши кратко физическо натоварване. Например раздвижване, подскок, разклащане на крайниците или лека разходка. Причината е, че движението подобрява микроциркулацията и увеличава локалното кръвоснабдяване в периферните части, като същевременно стимулира отделянето на застойна кръв и улеснява образуването на капка при пробождане. Също така, физическото усилие води до лека транссудация на плазма в тъканите, което намалява разреждането на патогените в кръвта и повишава шанса те да бъдат уловени в микроскопското поле.
Допълнително се препоръчва разтриване на пръста или ухото преди убождането. Масажът спомага за допълнително привличане на кръв в капилярната мрежа, затопляне на тъканта, понижаване на вискозитета на кръвта и по-добро капково изтичане. Това също намалява риска от образуване на микросъсиреци, които могат да затруднят разнасянето на капката по предметното стъкло и да нарушат качеството на натривката.
След пробовземането лаборантът използва предметно стъкло, като с помощта на второ стъкло или лабораторна шпатула разнася с бързо движение капката кръв по повърхността в тънък, равномерен слой. Това е критично важно, защото само най-тънките части на натривката позволяват ефективно наблюдение под микроскоп. В дебелите зони клетките се наслагват една върху друга, което прави идентификацията на вътреклетъчни и извънклетъчни паразити изключително затруднена или дори невъзможна.
По тази причина изключително добра практика е да се направят няколко натривки, обикновено три или четири, вместо да се разчита само на едно стъкло. Различните стъкла могат да се оцветят с различна наситеност, разнасянето може да бъде с различна дебелина, а понякога самата капка кръв съдържа различно разпределение на микроорганизмите. Чрез наблюдение на няколко натривки значително се увеличава вероятността за откриване на паразити, особено в случаите на ниска виремия или когато търсените обекти са редки и слабо представени.
Патогени, идентифицирани чрез кръвна натривка по Гимза
Натривката по Гимза е особено подходяща за вътреклетъчни и частично вътреклетъчни паразити, както и за някои бактерии. Най-класическите представители, откриваеми с този метод, са:
-
Plasmodium spp. (малария) — отлична видимост на различните стадии на паразита в еритроцитите
-
Babesia spp. — вътреклетъчен паразит, подобен на маларийния, често видим с характерни форми
-
Theileria spp. — паразити по подобие на бабезията, но с по-различен цикъл
-
Anaplasma spp. — бактерии от семейство рикетсии
-
Bartonella spp. — макар и трудна за директна визуализация, понякога се наблюдават характерни промени в еритроцитите и самите бактерии при добра техника
-
Toxoplasma gondii — рядко се улавя в кръвна натривка, но при остра виремия може да се види като тахизоити
-
Trypanosoma spp. — добре видими в плазмата на кръвта, при правилна подготовка
Има обаче важни ограничения. Един от най-често търсените патогени в контекста на хронични инфекции, спирохетите (като Borrelia spp.), не се откриват ефективно чрез натривка по Гимза. Причината е, че този вид оцветяване не оцветява добре тънки и дълги спираловидни структури. Спирохетите имат много слабо афинитет към основните багрила в Гимза, поради което остават почти незабележими на фона на кръвните елементи. Освен това, тяхната деликатна структура понякога се губи при процеса на изсушаване и фиксация на натривката. Въпреки това, не е абсолютно невъзможно да бъдат видени, особено при висока концентрация и внимателна работа, но това се счита за малко вероятно и ненадеждно като рутинна стратегия.
На графиката е изобразена скица на стандартно микроскопско стъкло, върху което е нанесена кръвна натривка, направена чрез размазване от ляво надясно (посоката е само примерна). В лявата част на изображението съм нарисувал по-дебелия слой кръв, който се образува в началото на размазването, където капката е най-концентрирана. Постепенно, при изтеглянето на натривката, кръвта се разстила по-тънко към дясната страна, като накрая практически избледнява и става почти невидима с просто око.
Именно този тънък, почти прозрачен край на натривката представлява най-подходящата зона за микроскопско наблюдение. В този участък еритроцитите лежат в единичен слой, не се застъпват и не се наслагват, което позволява ясно и прецизно разпознаване на вътреклетъчни паразити, включвания, както и промени в морфологията на клетките.
Тъй като обаче този тънък, оптимален за наблюдение слой заема относително малка част от цялата площ на намазката, съществува реална възможност лабораторният оператор да не разполага с достатъчно материал за надежден анализ, особено ако качеството на разнасяне не е перфектно. Именно поради това препоръчвам да се изготвят няколко натривки (3 или 4), така че да се увеличи шансът за получаване на достатъчно голяма площ с качествен тънък слой. Това значително повишава вероятността за откриване на паразити или други микроорганизми, които при еднократна проба могат да останат незабелязани.
Аз наблюдавам под микроскопа всички стъкла.
Цената на една натривка е около 3-4 лв. Лабораторията ще начисли и допълнителна обща "такса пробовземане", която е около 5 лв. Около 20 лв общо ще бъде общата стойност. Ще получите стъклата си вероятно след около 20-30 минути в кутийка. Вече сте готови за същинската част. Микроскопското наблюдение.
Кръв за микроскопия на тъмно поле (Dark Field Microscopy, DFM)
Друг метод с висока информативност в определени случаи е тъмнополето, известно още като микроскопия на тъмно поле или DFM. Това е техника, при която обектите се наблюдават в реално време, в неоцветена прясна капка кръв, където те изпъкват на тъмен фон чрез странично осветяване. Този метод е особено подходящ за спирохети като Borrelia, Treponema spp. и Leptospira spp., тъй като спираловидните им тела отразяват страничната светлина и стават ярко видими в движение.
Преди даване на капка кръв за тъмнополева микроскопия също се препоръчва кратко физическо усилие и масажиране на мястото на вземане, независимо дали ще се използва капилярна или венозна кръв. Това, както и при натривката, повишава вероятността да се улови активно движещ се патоген. При капилярна кръв отново е уместно леко разтриване на пръста. При венозна се прави топъл компрес и масаж на предмишницата. Те могат да подобрят микроциркулацията и да доведат до по-добро представяне на паразитите и бактерии в пробата.
Интересен и нерядко пренебрегван аспект е, че някои оператори и лаборатории имат специфични изисквания преди изследването. Например в Румъния съществуват лаборатории, които изискват диета без животински белтъчини в продължение на 48 часа, без алкохол и кафе, с цел намаляване на артефактите в кръвта, които могат да объркат интерпретацията. В други страни такива изисквания липсват или се считат за излишни. Важно е пациентът да се съобрази с конкретните инструкции на лабораторията, в която ще прави изследването, защото техниката е чувствителна към замърсявания и неправилна подготовка.
DFM не е подходяща за наблюдение на всички видове микроорганизми. Организми, които не се движат активно, нямат отчетливи граници или не отразяват светлината ефективно, могат да останат напълно незабелязани в тъмнополето. Това включва вътреклетъчни паразити като Plasmodium или Babesia, които се виждат най-добре в оцветени натривки. Също така, липсата на фиксация и оцветяване прави разграничаването между патоген и нормални клетъчни структури по-трудно и изисква изключително опитен оператор. Ето защо DFM е подходящ главно за спирохети.
Интерпретация на резултатите и съображения при наблюдението
След събирането на кръвните проби и подготовката на натривките или тъмнополевите препарати, ключовата роля преминава към микроскописта. Независимо дали става дума за изследване по Гимза или DFM, качеството на наблюдението и интерпретацията е от решаващо значение. Това включва не само техническата компетентност на оператора, но и методологията на самото наблюдение – кои зони от натривката се изследват, с какво увеличение, колко време се отделя за всяка зона и какво точно се търси.
При натривката по Гимза, най-ценните за наблюдение са т.нар. монослойни участъци. Това са зони, в които еритроцитите лежат в единичен слой, без застъпване и наслагване. Там могат ясно да се разпознаят паразити в еритроцити (като Plasmodium или Babesia), както и включвания в левкоцити (като при Anaplasma).
Обичайна грешка, особено при неспециализирани лаборатории, е използването на твърде малко увеличение, което прави паразитите практически невидими или трудноразпознаваеми. Също така, при недостатъчно време за наблюдение или изследване само на едно стъкло, има значителен риск от фалшиво негативен резултат, особено при хронични инфекции, при които патогените са малко на брой или се появяват само епизодично в кръвта.
Важно е да се подчертае, че няма „универсално стъкло“, което да даде пълната картина. Затова, както вече беше посочено, изследването на няколко различни натривки значително повишава шансовете за откриване на патогените. Това особено важи при инфекции с Babesia, където в една и съща проба някои натривки може да не съдържат видими паразити, докато други разкриват типичните интраеритроцитни форми. Същото важи и за Bartonella, където единствено при много внимателно разнесена и изсушена натривка може да се видят евентуални извънклетъчни форми или типични промени по повърхността на еритроцитите, свързани с инфекцията.
В тъмнополевата микроскопия най-важният ориентир е движението на микроорганизмите. Тъй като DFM не използва оцветяване, границите между различните структури са много по-трудни за разграничаване и се разчита главно на кинетичното поведение на обектите. Спирохетите, например, се движат с характерно въртеливо движение, комбинирано с вълнообразно придвижване напред, което лесно ги отличава.
От друга страна, множество небиологични елементи (напр. микроскопични кристали, остатъци от мазнини, капки холестерол, аморфни утайки от храни) също могат да се появят в препарата, особено ако няма добра диета и хигиена преди изследването. Именно затова някои лаборатории изискват диетичен режим, не толкова защото той „разкрива паразити“, а защото намалява фоновия шум и вероятността от объркване.
Тъмнополевата микроскопия не е подходяща за наблюдение на вътреклетъчни патогени. Те, дори и да присъстват, остават скрити в клетките и са практически невидими при липса на оцветяване. Така например Plasmodium, Babesia, Theileria или Anaplasma не могат да бъдат идентифицирани чрез DFM. Също така, неподвижни бактерии и паразити, които не отразяват странична светлина, не се виждат. DFM има и още едно ограничение.
Допълнителни препоръки за пациента и изследователя
И при двата метода, пациентът трябва да бъде спокоен, хидратиран и избягвал лекарства, добавки и стимуланти поне 12–24 часа преди изследването, освен ако няма медицинско указание да не го прави. Това важи особено за DFM, където кофеин, никотин и мазнини могат да изкривят плазмения профил и да затруднят анализа. Добра идея е и да не се консумират червени меса, много мазнини, млечни продукти и алкохол в деня преди пробовземането, както и да не се прилага тежка физическа активност в часовете преди теста, освен препоръчаната кратка загрявка. При микроскопско наблюдение на кръвна натривка по Гимза могат да се приложат същите диетични препоръки.
От страна на наблюдателя, изключително важно е да се осигурят идеални технически условия: микроскоп с подходящо увеличение, правилно калибрирано осветление (особено при DFM), качествени стъкла и багрила с ненарушен срок на годност. Задължителна е и достатъчна продължителност на наблюдението. Не трябва да се бърза. При всякакви съмнения, повторно наблюдение и сравнителен анализ на различни участъци е за предпочитане пред прибързани изводи.
Комбинирано приложение и стратегии
Макар че и двете техники, Гимза и DFM, имат своите ограничения, тяхното комбинирано използване позволява значително разширяване на диагностичния обхват. С Гимза се откриват вътреклетъчни паразити и някои бактерии, невидими при DFM, докато тъмнополето улавя живи, подвижни патогени, особено спирални бактерии, които не се откриват добре с оцветяване. При случаи със съмнение за коинфекции или хронични инфекции, при които симптомите не се обясняват с единствен причинител, двойното изследване е най-разумният и продуктивен избор.